Proponente: Università del Piemonte Orientale – Centro SLA Ospedale Maggiore della Carità Novara
Date stimate di inizio e fine: maggio 2022 – aprile 2023
Razionale: La Sclerosi Laterale Amiotrofica (SLA) è una grave patologia neurodegenerativa rara e progressiva caratterizzata dalla degenerazione selettiva dei motoneuroni cerebrali e spinali. Il tasso di incidenza medio è 2-3 casi / 100.000 abitanti / anno.
Vari e differenti sono i meccanismi di danno a carico dei motoneuroni, tra cui lo stress ossidativo, il danno dei neurofilamenti, le anomalie mitocondriali, l’eccitotossicità correlata al glutammato e risposte correlate all’ipossia. In particolare, nella SLA lo stress ossidativo appare intimamente legato a una serie di eventi cellulari che contribuiscono alla degenerazione e alla morte dei motoneuroni. Infatti, le analisi del tessuto neuronale post-mortem di pazienti con SLA mostrano costantemente un danno ossidativo a proteine, lipidi e DNA, suggerendo che il danno ossidativo potrebbe essere uno dei principali meccanismi cellulari responsabile della degenerazione dei motoneuroni. Le recenti acquisizioni evidenzierebbero, inoltre, il ruolo cruciale mediato dall’unità neurovascolare (NVU), network costituito da cellule endoteliali vascolari, neuroni e cellule gliali, nella patogenesi della malattia. Alterazioni della NVU potrebbero rappresentare l’evento scatenante alla base della degenerazione dei motoneuroni.
Definire il ruolo di agenti che possano prevenire la progressione dei sintomi impedendo la degenerazione dei motoneuroni, è fondamentale per gli sviluppi terapeutici. Allo stato attuale, solo riluzolo, ad azione antiglutammatergica, è stato approvato come terapia.
L’acetil-L-carnitina (ALCAR) è una sostanza presente in natura che, se somministrata a concentrazioni sovrafisiologiche, in modelli animali, è risultata neuroprotettiva tramite molteplici meccanismi d’azione, tra cui la modulazione del metabolismo ossidativo, il meccanismo antiossidante e l’inibizione dell’eccitotossicità.
In uno studio preliminare abbiamo esaminato il sistema redox nel plasma di pazienti affetti da SLA e ne abbiamo indagato l’effetto sulla sopravvivenza cellulare, sullo stress ossidativo e sulla funzione mitocondriale in Cellule Endoteliali Umane derivate dal Cordone ombelicale (HUVEC), astrociti e cellule muscolari, osservando quantificabili alterazioni del sistema redox, tra cui un aumento dei marcatori di ossidazione lipidica e una riduzione del monossido d’azoto (NO).
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Nel dettaglio, come riportato in figura 1, i risultati ottenuti hanno evidenziato come il plasma di 20 pazienti prelevato al reclutamento (T0) presenti livelli di TBARS, marcatori di perossidazione lipidica, superiori rispetto a quelli dei controlli sani.
Quantificazione dei livelli di TBARS nel plasma di pazienti SLA al T0 (reclutamento) e dei controlli sani (C). I numeri da 1 a 20 rappresentano i 20 pazienti testati. I risultati sono la media +/- DS di tre diverse quantificazioni (figura 1).
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La presenza di un’alterazione del sistema redox nel plasma dei soggetti affetti da SLA è stata confermata dalla quantificazione del GSH, uno dei principali antiossidanti, che è risultato ridotto rispetto ai controlli sani (figura 2).
.a presenza un’alterazione del sistema redox nel plasma dei soggetti affetti da SLA è stata confermata dalla quantificazioneel GSH, uno dei principali antiossidanti, che è risultato ridotto rispetto ai controlli sani (fig
Figura 2. Quantificazione dei livelli di GSH nel plasma di pazienti SLA al T0 e dei controlli sani (C). I numeri da 1 a 20 rappresentano i 20 pazienti testati. I risultati sono la media +/- DS di tre diverse quantificazioni.
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E’ interessante sottolineare come il dosaggio dell’NO plasmatico abbia anche evidenziato la presenza di livelli ridotti nel plasma dei pazienti affetti da SLA a confronto con quanto osservato nei controlli sani (figura 3). Questo risultato potrebbe indicare la presenza di un’alterazione della funzione endoteliali nei pazienti del nostro studio.
Figura 3. Quantificazione dei livelli di NO nel plasma di pazienti SLA al T0 e dei controlli sani (C). I numeri da 1 a 20 rappresentano i 20 pazienti testati. I risultati sono la media +/- DS di tre diverse quantificazioni.
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Quanto appena affermato viene confermato e messo in risalto dalla media delle misurazioni effettuate in tutti i pazienti per ciascun parametro (figure 4-6).
Figura 4. Confronto tra il valore medio dei livelli di TBARS (+/- DS) nel plasma di pazienti SLA al T0 e dei controlli sani (C). Pz indica i pazienti. I TBARS sono rappresentati come produzione di malonildialdeide (MDA). La parentesi quadra indica la significatività statistica tra i due gruppi (p<0.05)
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Figura 5. Confronto tra il valore medio dei livelli di GSH (+/- DS) nel plasma di pazienti SLA al T0 e dei controlli sani (C). Pz indica i pazienti. La parentesi quadra indica la significatività statistica tra i due gruppi (p<0.05)
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Figura 6. Confronto tra il valore medio dei livelli di NO (+/- DS) nel plasma di pazienti SLA al T0 e dei controlli sani (C). Pz indica i pazienti. La parentesi quadra indica la significatività statistica tra i due gruppi (p<0.05)
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.Nelle HUVEC e negli astrociti abbiamo anche esaminato l’effetto del plasma prelevato dai controlli sani e da 5 pazienti selezionati sulla base di caratteristiche cliniche, sulla vitalità cellulare, il potenziale di membrana mitocondriale e la produzione di NO.
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Come riportato nella figura 7, il plasma dei pazienti selezionati ha causato una spiccata riduzione della vitalità cellulare e del potenziale di membrana mitocondriale di HUVEC e astrociti, e ha ridotto il rilascio di NO da parte delle HUVEC (figura 8).
Figura 7. Effetto del plasma dei 5 pazienti sulla vitalità cellulare (A, B) e sul potenziale di membrana mitocondriale (C, D), nelle HUVEC (A e C) e negli astrociti (B e D), al T0. Cs= controllo sano, C= cellule controllo non trattate. I risultati sono riportati come la media ± DS di tre esperimenti indipendenti ripetuti in triplicato. I numeri 1, 3, 6, 8, 10 indicano i pazienti testati.
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Figura 8. Effetto del plasma dei 5 pazienti sul rilascio di NO nelle HUVEC al T0. C: controllo sano; Cell: cellule controllo non trattate; 1, 3, 6, 8, 10 pazienti testati. I risultati sono riportati come la media ± DS di tre esperimenti indipendenti ripetuti in triplicato.
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Tutti i parametri in esame hanno confermato, quindi, un maggiore danno ossidativo cellulare indotto dal plasma dei pazienti SLA al T0 sia nelle HUVEC che negli astrociti e una riduzione della funzione endoteliale nelle HUVEC.
Ipotesi: il progetto che presentiamo ora prevede di effettuare le suddette valutazioni prima e dopo l’avvio di acetil-L-carnitina, con l’obiettivo di valutare eventuali modifiche legate alla supplementazione terapeutica. Valuteremo l’effetto di acetil-L-carnitina sia in condizioni fisiologiche che di stress ossidativo, indotto sperimentalmente attraverso l’uso di perossido d’azoto. I risultati ottenuti dagli esperimenti in vitro verranno correlati con i dati demografici/funzionali di ogni singolo paziente di cui è stato utilizzato il plasma, valutando gli effetti che il trattamento con acetil-L-carnitina può determinare anche su specifici indicatori clinici (ALS- FRS, FVC, BMI).
L’obiettivo dello studio è di arruolare 50 pazienti con malattie dei motoneuroni, valutandone il sistema redox plasmatico alla diagnosi, e dopo tre e sei mesi dall’avvio della terapia con acetil-L-carnitina. In vitro, potremo anche esaminare l’effetto del plasma dei pazienti, prelevato alle diverse tempistiche, sulla funzionalità della NVU (HUVEC, astrociti) e delle cellule muscolari.
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Contatti:
1) Prof.ssa Elena Grossini: elena.grossini@med.uniupo.it
2) Dott.ssa Letizia Mazzini: letizia.mazzini@uniupo.it
3) Dott.ssa Fabiola De Marchi: fabiola.demarchi@uniupo.it
Per ulteriori informazioni, visita:
https://www.maggioreosp.novara.it/attivita-assistenziale/servizi-sanitari/centro-sla/
Come puoi sostenere questo studio?
Le donazioni possono essere effettuate tramite bonifico bancario all’associazione URSLA – Novara ODV su c/c presso BPM all’IBAN IT63P0503410100000000025664 specificando come causale: “Lo stress ossidativo nei pazienti con Sclerosi Laterale Amiotrofica: il ruolo dell’acetil-L-carnitina”
Vi ringraziamo!